Použití nástrojů QSAR k získávání ekotoxikologických dat

Úvod

V případě chemických havárií velkého rozsahu je nutno věnovat pozornost především látkám s akutní toxicitou, které představují bezprostřední environmentální riziko [1, 2]. Pro vyhodnocení následků úniků nebezpečných látek do ŽP a jejich mobilitu je potřeba znát fyzikálně chemické a ekotoxické vlastnosti látek. Nutnou podmínkou pro korektní odhad následků úniku toxických látek je znalost jejich nebezpečných účinků (působení na organismy) a dále dostupnost jednoznačných kritérií pro využívání toxikologických ukazatelů [3]. Především informace o ekotoxických vlastnostech nejsou standardně uváděny v bezpečnostních listech či databázích. Protože nebývá dostatek experimentálních dat, u méně známých nebezpečných látek by musela být provedena celá řada laboratorních testů, které jsou časově i finančně velmi náročné a navíc vyžadují diskutované používání laboratorních zvířat. Např. pro stanovení NPK je důležité nejprve provést testy akutní toxicity a navíc test detoxikace. Přechodnou kategorií mezi testy akutní a chronické toxicity jsou testy subchronické toxicity, založené na hodnocení fyziologických projevů a růstu s obdržením výsledků v krátké době (během 5 až 7 dní). Shrnutím všech uvedených charakteristik metodik, testů a vlastních testovacích organismů je využití testovacích organismů v následujících bateriích testů: v případě zjišťování ekologického rizika chemických látek a přípravků se používá baterie testů na řasách, perloočkách a rybách, v případě ekotoxicity a vyluhovatelnosti odpadů se používá baterie testů na řasách, semenech hořčice, perloočkách a rybách, v případě odpadních vod se doplňují baterie o stanovení na okřehku. Je proto většinou nutné použití dat náhradních a strategie Evropské unie i OECD tento postup podporují. [4] Z používaných matematických metod získávání dat o fyzikálně chemických a ekotoxických vlastnostech látek nutno zmínit metody statistické analýzy dat QSAR.

Rovnice QSAR

Rovnice QSAR (z ang. Quantitative Structure-Activity Relationships, kvantitativní vztah mezi chemickou strukturou a biologickou účinností) lze využít pro získání informací o toxických účincích chemických látek a jejich velikosti, o kinetických procesech, kterým chemické látky v organismu podléhají (absorpce, distribuce, metabolismus, vylučování), o distribuci a osudu chemických látek v životním prostředí a v neposlední řadě i o fyzikálně-chemických vlastnostech látek. [5] Analýza QSAR je analýzou souboru experimentálních údajů o velikosti biologických a fyzikálně - chemických vlastností látek metodami matematické statistiky. Soubor údajů se může týkat série látek strukturně podobných – homologická série, nebo strukturně různorodých – heterogenní série. Čím větší série, tím výhodnější je pro odvození QSAR modelu/rovnice. Rozsah hodnot biologických i fyzikálně chemických vlastností použitých k tvorbě modelu vymezují oblast jeho použitelnosti. Modely QSAR jsou matematické rovnice, jejichž levá strana představuje velikost biologické vlastnosti látky v logaritmickém tvaru, pravá strana představuje velikost vlastností fyzikálně chemických, topologických nebo kvantově chemických indexů (tzv. molekulové deskriptory). Příklady kvantifikovaných biologických aktivit:

• MIC - minimální inhibiční koncentrace u antimikrobiálních látek;
• LD₅₀ - dávka, při níž zahyne 50 % zvířat z testovacího souboru (vyjadřuje akutní toxicitu);
• ED₅₀ - dávka, při níž se sledovaný účinek projeví u 50 % zvířat z testovacího souboru (účinek je sledován kvalitativně: ano-ne);
• IC₅₀ - koncentrace látky, která způsobí pokles aktivity enzymu na 50 %;
• K_i - konstanta vyjadřující afinitu látky k receptoru;
• log BB - logaritmus „rozdělovacího koeficientu“ v soustavě mozek-krev; vyjadřuje schopnost látky pronikat přes hematoencefalickou bariéru. 

Klasické parametry mohou být hydrofobní, elektronové, sterické, ostatní - např.: kombinované z více výše zmíněných příspěvků (molární refrakce, parachor a jiné), topologické indexy a další. [6]

Nástroje metody QSAR

Pro účely predikce toxicity určité látky pomocí QSAR existuje řada softwarových nástrojů. Jedním z nich je např. T.E.S.T. (The Toxicity Estimation Software Tool), který byl vyvinut U.S. Environmental Protection Agency, a který umožňuje snadný odhad toxicity za použití škály různých metodik QSAR [7]. Z dalších volně dostupných nástrojů je třeba zmínit freeware EPI SUITE, vydaný rovněž US EPA, a obsahující sadu QSAR modelů pro odhad fyzikálně chemických a ekotoxikologických vlastností chemických látek [8]. Existují rovněž komerční QSAR nástroje. Mezi nejznámější patří MULTI-CASE [9], DEREK Lhasa limited, UK [10] a TOPKAT Accelrys Software Inc., USA [11].

Nástroj VegaNIC

VegaNIC je neinteraktivní klient pro běh modelů VEGA [12]. Je to samostatná aplikace na platformě JAVA, která umožňuje spouštět modely VEGA na místním počítači, bez interaktivního rozhraní. Nabízí možnost snadno spouštět jeden nebo více modelů a generované výsledky lokálně uložit. V současné době VegaNIC obsahuje 16 modelů, uvedených v tabulce 1 spolu s uvedením jejich původu.

Tab. 1: Přehled modelů nástroje VegaNIC

Pomocí VEGA můžeme přistupovat k sérii QSAR modelů pro regulační účely, nebo vytvořit svůj vlastní model pro výzkumné účely. Modely byly převzaty ze softwarů CAESAR^[1] nebo T.E.S.T.^[2], nebo byly vyvinuty v rámci VEGA. Modely mohou být použity k predikci vlastností chemické látky na základě informací o její struktuře. Modely QSAR pro regulatorní účely byly optimalizovány v souladu s požadavky nařízení REACH [19].

Ve srovnání s mnoha existujícími modely QSAR je kladen větší důraz na to, aby modely poskytovaly transparentní, srozumitelné, reprodukovatelné a ověřitelné výsledky. Proto byla řada nástrojů optimalizována, což příznivě ovlivnilo výsledky získané pro cílové chemické látky i výsledky získané pro strukturně podobné sloučeniny. Nástroje proto také poskytují reprodukovatelný postup read-across. Read-across je postup pro extrahování požadovaných hodnot pro cílovou sloučeninu na základě známých hodnot pro strukturně podobné látky.
V programu VEGA toho bylo dosaženo implementací algoritmů, které jsou nezávislé na QSAR modelech, a které umožňují screening podobných sloučenin postupem read-across. Tyto algoritmy se používají jak k identifikaci podobných sloučenin a analýze vlivu deskriptorů a fragmentů, tak i pro cílové chemické látky a jim podobné sloučeniny. Z tohoto důvodu je také možné použít VEGA samostatně pro read-across. Pro toto omezenější použití je třeba postupovat stejně jako pro postup predikce, ale následně ignorovat predikovanou hodnotu, a místo toho jednoduše analyzovat podobné sloučeniny na bázi chemometrické a podobné sloučeniny identifikované na základě mechanismů a deskriptorů. Tímto způsobem je možno analyzovat a posoudit podobnosti mezi cílovou chemickou látkou a příbuznými látkami. [20]

Příklady použití

V prostředí VegaNIC byl aplikován model 96 hour fathead minnow LC₅₀ na skupinu látek, které byly nově zařazeny jako vyjmenované do přílohy I směrnice Seveso III [1]. Jedná se o látky uvedené v tabulce 2.

Tab. 2. Látky nově zařazené do Přílohy I směrnice Seveso III

V tabulce 3 jsou uvedeny výsledky predikce LC₅₀ 96h [-log (mol/l)] pro vybraných 13 látek a hodnocení spolehlivosti modelů.

Celkově z tohoto souboru 13 látek pět vykázalo nízkou spolehlivost modelu, pět střední a tři vysokou spolehlivost modelu.

Z analyzovaných látek byly pro dvě z nich (propylamin a 3-methylpyridin) k dispozici experimentální data; oba vypočtené výsledky vykazují minimální odchylku od experimentální hodnoty – viz tabulka 4.

Tab. 3: Souhrn predikcí modelu Fathead Minnow LC₅₀ 96h [-log (mol/l)]

Tab. 4: Hodnocení modelu Fathead Minnow LC₅₀ 96h pro propylamin a 3-methylpyridin

Jako další z modelů nástroje VegaNIC byl použit model BCF - biokoncentrační faktor. Tento model poskytuje kvantitativní predikce biokoncentračního faktoru (BCF) u ryb, uvedené v log (L/kg). Model byl aplikován na látku propylamin (CAS 107-10-8). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 5.

Tab. 5: Výsledky predikce a analýzy oblasti použitelnosti modelu BCF

Hodnocení modelu: predikce je logBCF = 0,18, ale výsledek může být nespolehlivý.

Byly nalezeny pouze mírně podobné látky se známými experimentálními hodnotami v tréninkové sadě. Deskriptory této sloučeniny mají hodnoty mimo rozsah sloučenin tréninkové sady, jak je patrné z níže uvedených diagramů.

Na obr. 1 je uvedena analýza deskriptoru LogP, který je v přímé korelaci s hodnotou logBCF. Diagram MLogP proti hodnotám odezvy: experimentální hodnoty jsou uvedeny pro tréninkovou množinu, predikovaná hodnota pro testované látky. Světle modré tečky představují hodnoty látek z tréninkové sady, červená tečka je hodnota zkoumané látky.

Obr. 1: Diagram MLogP proti hodnotám odezvy

Na obrázku 2 je uveden diagram MLogP proti hodnotám odezvy pouze tří nejpodobnějších látek v tréninkové sadě. Červená tečka je hodnota sledované sloučeniny, černé kruhy představují experimentální hodnoty sloučenin z tréninkové sady, černé tečky představují predikovanou hodnotu stejné sloučeniny, velikost kruhu je úměrná podobnosti zkoumané sloučeniny.

Obr. 2: Diagram MLogP proti hodnotám odezvy pouze tří nejpodobnějších látek v tréninkové sad

Závěr

Nasazení nástroje VegaNIC představuje další významný krok v oblasti použití QSAR pro získávání dat o fyzikálně chemických a ekotoxických vlastnostech látek pro účely regulační i výzkumné. Použití vyžaduje pečlivé hodnocení spolehlivosti modelů a správnou interpretaci výsledků pro studované sloučeniny.

Použitá literatura

[1] Směrnice Rady 96/82/ES ze dne 9. prosince 1996 o kontrole nebezpečí závažných havárií s přítomností nebezpečných látek.

[2] Směrnice Evropského Parlamentu a Rady 2012/18/EU ze dne 4. července 2012 o kontrole nebezpečí závažných havárií s přítomností nebezpečných látek a o změně a následném zrušení směrnice Rady 96/82/ES.

[3] Nařízení Evropského parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 ze dne 16. prosince 2008 o klasifikaci, označování a balení látek a směsí, o změně a zrušení směrnic 67/548/EHS a 1999/45/ES a o změně nařízení (ES) č. 1907/2006 (Text s významem pro EHP).

[4] OECD Environment Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 69 : Guidance Document on the Validation of (Quantitative) Structure-Activity Relationship :QSAR Models. Paris : Environment Directorate ORGANISATION FOR ECONOMIC CO-OPERATION AND DEVELOPMENT, 2007.

[5] HANSCH, C. …[et al.]. Correlation of Biological Activity of Phenoxyacetic Acids with Hammett Substituent Constants and Partition Coefficients. Nature, 1962, 194, pp. 178-180.

[6] TICHÝ, M. Predikční toxikologie [online]. Státní zdravotní ústav, 14. březen 2008. Dostupný z WWW: <http://www.szu.cz/tema/pracovni-prostredi/predikcni-toxikologie#article >.

[7] EPA. Quantitative Structure Activity Relationship [online]. EPA. Dostupný z WWW: <http://www.epa.gov/nrmrl/std/qsar/qsar.html >.

[8] EPA. Estimation Program Interface (EPI) Suite [online]. EPA, c2000-2012. Dostupný z WWW: <http://www.epa.gov/oppt/exposure/pubs/episuite.htm >.

[9] Multicase Inc Software [online]. MultiCASE, Last modified: 02/13/13. Dostupný z WWW: <http://www.multicase.com>.

[10] DEREK Lhasa [online]. Dostupný z WWW: <https://www.lhasalimited.org/derek_nexus>.

[11] Laboratory of Mathematical Chemistry [online]. c2013. Dostupný z WWW: <http://www.oasis-lmc.org>.

[12] VEGA [online]. Milano : Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri. Dostupný z WWW: < http://www.vega-qsar.eu/index.php>.

[13] CAESAR : Conmputer Assisted Evaluation of Industrial Chemical Substances according to Regulations [online]. Milano : Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri. Dostupný z WWW: <www.caesar-project.eu>.

[14] QSARs [online]. U.S. EPA. Dostupný z WWW: <www.epa.gov/nrmrl/std/cppb/qsar>.

[15] DEMETRA : Development of Environmental Modules for Evaluation of Toxicity of pesticide Residues in Agriculture [online]. Dostupný z WWW: <www.demetra-tox.net>.

[16] Toxtree [online]. Ideaconsult, Last Published: 2013-07-10. Dostupný z WWW: <www.toxtree.sourceforge.net>.

[17] SARpy : User’s Manual [online]. Dostupný z WWW: <ftp://ftp.elet.polimi.it/users/Giuseppina.Gini/SARpy_v1.0/SARpy%20Manual-3.doc>.

[18] Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri [online]. Milano, Ultimo aggiornamento: 28 agosto 2013. Dostupný z WWW: <http://www.marionegri.it/mn/it/index.html>.

[19] Nařízení Evropského Parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 ze dne 18. prosince 2006 o registraci, hodnocení, povolování a omezování chemických látek, o zřízení Evropské agentury pro chemické látky, o změně směrnice 1999/45/ES a o zrušení nařízení Rady (EHS) č. 793/93, nařízení Komise (ES) č. 1488/94, směrnice Rady 76/769/EHS a směrnic Komise 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES.

Vzorová citace

FORINT, Pavel. Použití nástrojů QSAR k získávání ekotoxikologických dat. Časopis výzkumu a aplikací v profesionální bezpečnosti [online]. 2013, roč. 6, č. 2. Dostupný z WWW: <http://www.bozpinfo.cz/josra/josra-02-2013/nastroje-qsar.html>. ISSN 1803-3687.

ekotoxicita=stitek

havárie=stitek

klasifikace=stitek

nebezpečné látky=stitek